1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
H5亚型和H9亚型禽流感严重威胁中国养鸡业的发展。禽流感灭活疫苗对中国禽流感的防控发挥了重要作用。由于流感病毒自身易于变异[1]，使得现有的疫苗难以对新出现的变异株提供有效保护[2]，需要不断筛选和更新与流行毒株抗原性一致的疫苗毒株。而筛选新疫苗毒株至新毒株疫苗用于临床，存在一段窗口期。临床生产亟需通过更换毒株之外的其他方法提高现有疫苗的保护效力。使用免疫增强剂是提高现有疫苗保护效力的有效途径之一。本研究在现有H9亚型禽流感油乳剂灭活疫苗的基础上,添加聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid, PoIyI:C)作为免疫佐剂，免疫雏鸡，通过检测血清中禽流感血凝抑制(hemagglutination inhibition, HI)抗体的水平、细胞因子水平以及攻毒保护试验，从体液免疫和细胞免疫两方面来评价聚肌胞的免疫增强作用，为研制出一种新的高效广谱禽流感H9N2灭活疫苗，探索一条新途径。
禽流感是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类疾病，可引起鸡、火鸡及其它禽类的感染，主要侵害呼吸系统、消化系统及神经系统。H9N2亚型禽流感是由H9N2亚型禽流感病毒引起的禽类感染，可使家禽产生轻微的呼吸道症状，一般不会导致感染家禽大批死亡[3]。禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少，产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率均高，人感染高致病性禽流感死亡率约是60%，家禽感染的死亡率几乎是100%。禽流感的症状依感染禽类的品种、年龄、性别、并发感染程度、病毒毒力和环境因素等而有所不同，主要表现为呼吸道、消化道、生殖系统或神经系统的异常。常见症状有：病鸡精神沉郁，饲料消耗量减少，消瘦；母鸡的就巢性增强，产蛋量下降；轻度直至严重的呼吸道症状，包括咳嗽、打喷嚏和大量流泪；头部和脸部水肿，神经紊乱和腹泻。感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡。这些症状中的任何一种都可能单独或以不同的组合出现。有时疾病暴发很迅速，在没有明显症状时就已发现鸡死亡。禽流感潜伏期从几小时到几天不等，其长短与病毒的致病性、感染病毒的剂量、感染途径和被感染禽的品种有关。禽流感病毒主要引起蛋鸡的产蛋量下降和较高的发病率，养殖场一旦感染禽流感(H9N2)病毒就很难清除，因此其对世界家禽养殖造成了很大的经济损失[4]。1994年中国和韩国等爆发了严重的禽流感(H9N2)后，该病毒就一直存在这些国家的养殖场里[5]。1998年A/chicken/Shandong/6/1996(Ck/SD/6/96)商品灭活苗首次在我国批准使用，据统计，我国目前已经商品化的H9N2禽流感疫苗毒株多达13种以上，正是这种免疫压力使我国H9N2禽流感疫情变得更加复杂，因此需要我们从不同角度来研究禽流感H9N2灭活疫苗。目前，人用流感疫苗免疫增强剂研究已成为国外研究热点。实验表明，一些TLR,NLR受体激动剂十分安全，能显著提高机体的体液和细胞免疫水平。H9N2亚型禽流感对我国养鸡业造成了巨大损失,现有多种H9亚型禽流感灭活疫苗用于临床免疫预防。免疫压力促进新出现的变异株,免疫鸡场仍可不断分离出H9亚型禽流感病毒。因此,进一步提高H9亚型禽流感疫苗免疫效力,特别是提高疫苗的交叉保护效力十分必要。免疫佐剂是能提高疫苗免疫效力的一类生物活性物质,相关研究近年来成为国外研究热点。聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid, PoIyI:C)是高分子多聚核普酸类物质之一，由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸单链组成的双股多核苷酸链[6]。PoIyI:C是动物体内3型Toll样受体的配体，聚肌胞激活TLR-3后可介导机体一系列的免疫反应，如诱导干扰素、白介素、肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌，促进NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞及树突状细胞的增殖与成熟，促进体内抗体的生成[7]. polyI:C对机体的特异性免疫和非特异性免疫均有很好的促进作用。临床试验证明，PoIyI:C对具有广泛的抗病毒(如禽流感病毒[8]、疤疹病毒[9]等)抗菌作用。此外PoIyI:C可抑制肿瘤的生长[10]，对原虫(杜氏利什曼原虫[11]、约氏疟原虫[12])也有抵抗作用。
目前国内外已经研究报道了很多免疫佐剂与流感油乳灭活疫苗合用时，不仅能很好的刺激先天免疫系统和获得性免疫系统，还能对同亚型其他毒株，甚至其他亚型的禽流感病毒，产生很好的交叉保护作用的交叉保护抗体或者交叉保护的CTL。免疫增强剂能提高抗原的免疫原性，减少抗原免疫剂量、促进免疫原性较低的灭活病毒疫苗和亚单位疫苗等产生较好的免疫应答、增强免疫力较差群体(幼体、老年个体)的免疫应答等方面的报道在小鼠和人上已有很多报道。人用疫苗中，已经有部分免疫增强剂获得商品化，包括人流感疫苗佐剂MF59[13] 、疟疾疫苗佐剂AS02、单纯疱疹疫苗和人乳头瘤病毒疫苗佐剂AS04[14] 。兽用疫苗中，如猪支原体疫苗佐剂Amphiigen[15]等。但是免疫增强剂在刺激刺激免疫反应上还是存在种属差异和病原协同作用的差异，比如很多免疫佐剂在小鼠上具有很好的免疫增强效果，而在人或其他动物产生的免疫效果却较弱。并且很多佐剂的安全性问题依然令人担忧，虽然一些佐剂，如MF59,MPL和铝盐复合佐剂，已批准使用于人流感灭活疫苗中，而在美国批准使用的佐剂还只有铝佐剂。所以将免疫增强剂应用于禽流感H9N2灭活疫苗上，还需要进一步的大量研究。
本项目主要研究多聚核苷酸作为佐剂增强H9亚型禽流感灭活疫苗的作用，从体液免疫和细胞免疫两方面进行评价，同时对进一步提高现有的H9亚型禽流感灭活疫苗的免疫效力，探索一条新途径。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
研究多聚核苷酸作为佐剂增强H9亚型禽流感灭活疫苗的作用，主要从体液免疫和细胞免疫两方面进行评价。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
（1）H9亚型禽流感灭活疫苗联合聚肌胞苷酸的制备
（2）将鸡分5组，每组16只，一组作为对照组，其他四组作为试验组，试验组分别为 H9N2抗原 矿物油组、 H9N2抗原 矿物油 聚肌胞高剂量组、 H9N2抗原 矿物油 聚肌胞中剂量组、 H9N2抗原 矿物油 聚肌胞低剂量组，对照组注射同等体积的生理盐水。
（3）试验鸡养至20日龄左右，在确定HI效价后考虑注射疫苗（HI的效价≤31og2）进行首次免疫，首免后的第14天进行第二次免疫。
（4）首免后的第14、21、28天采血，分离血清，测HI抗体水平（反映体液免疫）和细胞因子（反映细胞免疫）。
（5）分析数据，评价各免疫效果。
技术路线：
鸡分五组，生理盐水组、H9 油佐剂组、H9 油佐剂 聚肌胞高剂量组、H9 油佐剂 聚肌胞中剂量组、H9 油佐剂 聚肌胞低剂量组 |
20日龄左右首免，首免后第14天进行二免，首免后第28天进行攻毒试验 |
评价各免疫效果 |
可行性分析：
本实验室在现有的H9亚型禽流感油乳剂灭活疫苗的基础上，添加聚肌胞作为免疫佐剂；同时具有完备的检测手段，可以保证实验完整而有效的进行。
4. 研究创新点
特色或创新之处：
1.本试验首次对多聚核苷酸与H9亚型禽流感灭活疫苗联合使用的免疫效果进行研究
2.本试验将对进一步提高H9亚型禽流感灭活疫苗的免疫效力，探索一条新途径。5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展：
2016年9月~10月：参考文献查询
2016年10月~11月：饲养试验鸡，H9亚型禽流感灭活疫苗联合多聚核苷酸的制备
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