1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
研究意义：
日本脑炎病毒（JEV）是一种由蚊子传播的黄病毒，是人类和动物中最常见的病毒性脑炎病原体之一，大多数病例发生在亚洲南部和东部。据调查显示，近30亿人有感染JEV的风险，每年在东亚大约有30,000至50,000例临床病例，其中10,000人死亡，病死率在20％至30％之间，其中在幸存者中约30％至50％获得永久性神经精神后遗症。同时JEV也可引起怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，公猪发生睾丸炎，对我国畜牧养殖业造成较大的经济损失。整合素αvβ3是JEV的受体之一，受体可以促进病毒的入侵与感染，构建αvβ3基因缺失的细胞体系有利于进一步研究受体的作用机制，为在细胞水平上探讨αvβ3与乙型脑炎病毒的感染的关系提供可应用的研究对象。
研究概况：
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
通过CRISPR-Cas9技术对整合素αvβ3进行基因编辑，掌握CRISPR-Cas9系统的基因组编辑技术及探讨对是否成功敲除αvβ3和敲除效率的验证，探究αvβ3缺失对JEV感染的影响。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
（1）sgRNA靶点选择及其寡核苷酸链合成。
（2）CRISPR／Cas9－sgRNA质粒构建。
（3）转染细胞并通过有限稀释法得到单细胞株。
（4）筛选并鉴定基因敲除细胞株。
（5）将野生型细胞与整合素敲除后的细胞株以相同的条件进行感染，24ｈ后收集细胞裂解液进行Westernblot检测JEV蛋白表达水平,研究整合素的缺失对JEV感染的影响。将重组质粒转染293T细胞，细胞接种并进行单细胞克隆培养并筛选单克隆细胞，蛋白免疫印迹，提取基因組DNA，PCR，T载体连接后测序鉴定敲除效果。最后将野生型细胞与整合素敲除后的细胞株以相同的条件进行感染，24ｈ后收集细胞裂解液进行Westernblot检测JEV蛋白表达水平,研究整合素的缺失对JEV感染的影响。
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| 将重组质粒转染293T细胞，利用有限稀释法培养并筛选单克隆细胞 |
| PCR测序 |
| 挑选阳性样本连接T载体，测序 |
| 接种JEV病毒，Westernblot检测JEV蛋白表达水平,研究整合素的缺失对JEV感染的影响。
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可行性分析：
CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术在动物建模、作物育种、基因治疗、药物开发以及工业生物工程等不同领域中得到广泛应用，是一项较为成熟的基因编辑技术。指导教师长期从事猪乙型脑炎的研究，研制了JEV各功能蛋白的单克隆抗体。依托实验室为农业部重点实验室，具备良好的工作基础；实验室已具备各种所需条件。实验设计中的其它各项关键技术均有研究资料可以借鉴。因此，本项目研究方案是完全可行的。
4. 研究创新点
本研究利用CRISPR-Cas9的技术敲除整合素αvβ3的第4外显子，构建整合素敲除的细胞体系，并在细胞分子的层面上检测敲除效率，并探究了该整合素敲除后对JEV 病毒感染的影响，为以后更加准确地探究整合素αvβ3受体的作用机制以及其对乙型脑炎病毒的感染打下了基础。
5. 研究计划与进展
2018.11—2018.12 设计gRNA 并构建载体。
2018.12—2019.03细胞转染，培养单克隆细胞，并进行单克隆测序鉴定。
2019.03—2019.05 Westernblot检测野生型细胞与整合素敲除后的细胞株的感染JEV蛋白表达水平，分析处理数据，总结实验结果，完成实验总结汇报。
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