1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变的接触性传染病［1］。该病多为继发感染，其发生多与病原的毒力、猪体的健康状况及饲养环境等因素密切相关。自1957 年首次报道以来，在欧美、日本等国相继被证实发生［2］。我国自 1987 年发现本病后，许多省都有报道。但由于病原菌血清型众多，不同血清型之间的交叉保护力不强，各地发生的病原血清型及临床症状存在较大差异，以及慢性型病例的长期存在等因素加大了该病的防控难度。近年来对此病虽然开展了大量研究，但导致本病的致病机理尚不十分明确，加之缺乏科学的预防措施，长期以来对我国养猪业的科学发展造成较大威肋。 胸膜肺炎放线杆菌血清型多达15种［3］，且目前还有很多不能定型的临床分离菌株，其流行率因地理区域而异，不同血清的毒力和免疫原性存在差异，国内流行的血清型主要是1，2，3，5，7型［4］。各血清型存在部分交叉免疫反应［5］。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染机体后，在对患病动物进行病史调查、临床症状的观察以及结合当地的流行病学特点等的基础上；对发病猪进行剖检，可见急性病例胸腔内有大量血样泡沫样渗出物；病程稍长的往往表现出明显的纤维素性肺炎，可见心包与肺脏粘连，胸膜与肺脏粘连等典型症状，慢性病例则以轻度呼吸困难和纤维素性肺炎为主症［6］，但由于临床猪感染疾病过程中多存在继发感染和混合感染，所以单纯的通过临床症状只能对本病做出初步判断，具体需结合实验室诊断，鉴定出致病微生物，进而确诊本病[7]。
该病的传染性很强，如若等发病之后才进行治疗，则会费时费力且效果不好，因此对该病的预防则显得尤为重要。疫苗作为预防和控制该病的有效手段，一直备受科研工作者的重视。常见的疫苗为以下几种:灭活疫苗、亚单位疫苗、弱毒活疫苗等[8]。目前在临床上使用的较多的是APP全菌灭活苗，其制作方法是从当地的病猪中分离出流行的优势菌株，并将分离的菌株纯化培养，再用福尔马林将其灭活，最后加入适当的佐剂制备而成。灭活苗的制作过程简单，应用广泛，但是缺陷也很明显。首先，灭活苗免疫猪产生的抗体滴度不高，因此不能避免再次感染APP。其次，由于灭活疫苗是体外表达，再通过大量培养而成，体外的培养环境与体内有较大的差异，产生的抗原成分也与体内表达有差异，因此灭活疫苗中可能会缺乏体内表达的一些抗原物质[9]。再次，在APP的众多血清型中，其表面抗原并不相同，因此不能提供良好的交叉保护作用[10]。最后，在制备灭活苗的过程中所用的物理或化学方法会造成抗原的破坏或是抗原成分的缺失，影响疫苗的临床效果。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标、内容和拟解决的关键问题
1.研究的目标
本次研究的目标主要是成功分离到血清型5型的胸膜肺炎放线杆菌分离株并为其疫苗的制备提供基础。
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
1.研究方法
（1）取出保存在冰箱中的送检病料放置在超净工作台中，无菌剪取一小块患有PCP病猪的肺脏病料，将其均匀涂布在加有NAD的THB固体培养基上，37℃培养18-24小时，结束后挑取培养基上可疑单菌落接入液体培养基，37 ℃培养18-24h。
（2）挑取培养的细菌进行革兰氏染色，并在光学显微镜下观察细菌的形态和染色特性。
（3）将分离菌接种到各生化管中培养24-48h后观察结果。
（4）将分离菌分别接种在含有NAD和不含有NAD的培养基上观察结果。
（5）对分离菌进行PCR鉴定和药敏试验。
（6）将一定剂量的细菌悬液注射到各试验组的小鼠的体内，接种后，隔离饲养并观察小鼠的发病和死亡情况。
（7）攻毒前确定仔猪体内一周的抗体水平后，再将一定剂量的细菌悬液注射到仔猪的体内检测仔猪的鼻拭子和死亡后各脏器的增菌PCR结果。
| 分离菌的染色镜检 |
2.技术路线和实验方案
| 分离菌的生化鉴定 |
| 细菌的分离培养 |
| 药敏试验 |
| 小鼠体内试验 |
| 分离菌的生长特性分析 |
| 仔猪攻毒试验 |
| 分离菌的PCR鉴定 |
3.可行性分析
由于我国集约化猪场近年来发展十分迅速，猪传染性胸膜肺炎的感染率和发病率日益增高，所以在送检的病料上很大可能检测到胸膜肺炎放线杆菌。我国主要流行的血清型为血清1型、血清3型、血清5型和7型。所以分离培养得到血清5型的胸膜肺炎放线杆菌的可能性也很大。
4. 研究创新点
现在国内流行的主要以胸膜肺炎血清型1，2，3，5，7型为主，其中1型的研究是最多也是最成熟的，预防起来比其他几个血清型也较为容易。现在国内外做血清型5型的研究很少，相应的疫苗也没有研制出来，这次的研究就是为了能够制备出针对胸膜肺炎血清5型的疫苗，减少我国养猪业因为该病原菌导致的胸膜肺炎引起的经济损失。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
（1）2018.9-2018.10 对病原菌的分离培养，待培养皿上长出菌落后挑取分离培养的菌进行染色镜检和生化鉴定。然后挑取培养菌分别接种在含有NAD的培养皿上和不含有NAD的培养皿上，观察试验结果。吸取分离培养得到的菌液进行PCR鉴定然后吸取菌液涂布培养皿，贴上药敏片进行药敏试验。
（2） 2018.10-2018.11小鼠的体内试验，观察48h内的小鼠死亡情况。
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