1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.项目的研究意义
奶牛乳房炎是由微生物感染、理化因素刺激引起的一种奶牛乳腺炎症，主要临床特征是乳房的理化性质发生改变、乳腺组织产生病理性改变等，该病在世界范围内广泛存在，是一
种常见、多发性疾病。临床上以隐性乳房炎发生更为常见，主要危害有产奶量明显减少、奶的品质严重下降使其保健作用大大降低、母牛繁殖能力下降，此外治疗该病还会产生高额的
2. 研究的基本内容和问题
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研究目标
1.1总结分析近两年中国奶牛乳房炎致病菌的分布情况
1.2采用MLST分子分型和spa分型的方法研究临床分离的奶牛乳房炎病原中金黄色葡萄球菌的相关性
剩余内容已隐藏，您需要先支付后才能查看该篇文章全部内容！3. 研究的方法与方案
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研究方法
1.1临床收集奶牛乳房炎奶样采用血平板和麦康凯平板进行细菌分离鉴定，进行表型观察，生化反应及细菌基因测序，确定细菌种属，将致病菌冻存。
1.2将分离到的金黄色葡萄球菌提取DNA，根据MLST分型和spa分型的已知文献设计合成引物，进行PCR，并将产物测序得到结果，进行分型分析。
1.3对临床分离到的金黄色葡萄球菌进行药敏试验，测定其中MRSA，并进行相关基因的检测。
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实验方案
2.1材料和仪器
金黄色葡萄球菌标准参考株、临床分离金黄色葡萄球菌、细菌DNA抽提试剂盒、PCR仪、离心机等
2.2实验步骤
2.2.1乳房炎病原分离鉴定
临床送检奶样，用无菌棉签在鲜血琼脂培养基及麦康凯培养基上涂板，置37℃温箱中培养24h，取平板上单个菌落于THB培养基中培养10h，利用直接煮沸法提取细菌基因组。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成细菌16S RNA通用引物对：16S-27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和16S-1492R：5'-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。采用40μL扩增体系:上、下游引物各2μL，分离菌基因组DNA 2μL，PCRMix15μL，ddH2O 19μL。反应条件：94℃5 min;94℃1 min，52℃30 s，72℃1.5 min，30个循环;72℃10 min。预期PCR产物为1 500 bp左右，送金斯瑞生物科技有限公司测序。将测得的基因序列在GenBank中进行核酸BLAST序列比对。
2.2.2金黄色葡萄球菌MLST分型及spa分型
MLST
DNA模板：试剂盒提取
引物
基因名称
引物
序列（5’-3’）
长度
Carbamate kinase
arc C-F
TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC
456
arc C-R
AGGTATCTGCTTCAATCAGCG
Shikimate
dehydrogennase
aro E-F
ATCGGAAATCCTATTTCACATTC
456
aro E-R
GGTGTTGTATTAATAACGATATC
Glycerol kinase
glp F-F
CTAGGAACTGCAATCTTAATCC
465
glp F-R
TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC
Guanylate kinase
gmk-F
ATCGTTTTATCGGGACCATC
429
gmk-R
TCATTAACTACAACGTAATCGTA
Phosphate
acetyltransferase
pta-F
GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG
474
pta-R
GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA
Triosephosphate
isomerase (tpi)
tpi-F
TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA
402
tpi-R
TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC
Acetyl coenzyme A
acetyltransferase
yqi L-F
CAGCATACAGGACACCTATTGGC
516
yqi L-R
CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC
体系
试剂
用量（μl）
Mix
25
F
2
R
2
DNA模板
1
dH2O
20
总计
50
PCR反应条件
对 7个金葡的管家基因PCR扩增采用以下循环参数：
预变性
94℃
5min
变性
94℃
30s
退火
53℃
30s
延伸
72℃
1min
终延伸
72℃
5min
电泳检测
产物测序
公司进行双向测序。对测序结果中出现的杂峰及峰间相互重叠的情况进行整理。使用
ContigExpress 软件对上下引物产物的序列进行拼接。
将拼接序列导入CLC Sequence Viewer 7 软件中，截取与相应管家基因的相同长度且同源的片段序列，上MLST国际数据库（http://www.mlst.net）进行比对，获得相应管家基因的等位基因编号，若序列与数据库中序列存在差异则定义为新的等位基因，综合所有等位基因确定序列分型（ST），使用 eBurst v3.0 显示MLST分析结果，分析不同ST之间的相关性。
SPA分型
DNA模板：试剂盒提取
引物
基因名称
引物
序列（5’-3’）
Spa
Spa-F
AGACGATCCTTCGGTGAGC
Spa-R
GCTTTTGCAATGTCATTTACTG
体系
试剂
用量（μl）
Mix
25
F
2
R
2
DNA模板
1
dH2O
20
总计
50
PCR反应条件
对spa基因PCR扩增采用以下循环参数：
预变性
94℃
5min
变性
94℃
30s
退火
55℃
45s
延伸
72℃
90s
终延伸
72℃
5min
电泳检测
产物测序
公司进行双向测序。对测序结果中出现的杂峰及峰间相互重叠的情况进行整理。使用
ContigExpress 软件对上下引物产物的序列进行拼接。
spa法:对测序结果进行比对分析，spa基因24 by重复序列区域的两端是相对保守的序列。其5’端的标志序列为GCACCAAAA，与重复序列5’端起始相距0 bp，而3'端的标志是CCTGGTAAA，与重复序列3’端末尾相距18bp或19bp。按照这规则截取spa重复序列区域，并按照24 by分割成不同的重复单元。登录网站http: //www. ridom. de/spaserver/，依次搜索到重复单元的编号，将所有重复单元的编号按照5'-3’的顺序依次输入，得到菌株的spa型别。
2.2.3金黄色葡萄球菌药敏试验及相关基因检测
药物敏感性测定：mecA、mecC基因测定：根据CLSI将金黄色葡萄球菌对头孢西丁耐药的的筛选出来，测定mecA和mecC基因。
mecA基因检测：
DNA模板：试剂盒提取
引物
基因名称
引物
序列（5’-3’）
长度
mecA
mecA-F
TCCAGATTACAACTTCACCAGG
162bp
mecA-R
CCACTTCATATCTTGTAACG
体系
试剂
用量（μl）
Mix
25
F
2
R
2
DNA模板
1
dH2O
20
总计
50
PCR反应条件
对spa基因PCR扩增采用以下循环参数：
预变性
94℃
5min
变性
94℃
30s
退火
55℃
30s
延伸
72℃
35s
终延伸
72℃
10min
电泳检测
mecC基因测定
DNA模板：试剂盒提取
引物
基因名称
引物
序列（5’-3’）
长度
mecC
mecC-F
GAAAAAAAGGCTTAGAACGCCTC
138bp
mecC-R
GAAGATCTTTTCCGTTTTCAGC
体系
试剂
用量（μl）
Mix
25
F
2
R
2
DNA模板
1
dH2O
20
总计
50
PCR反应条件
对spa基因PCR扩增采用以下循环参数：
预变性
94℃
5min
变性
94℃
30s
退火
55℃
30s
延伸
72℃
35s
终延伸
72℃
10min
电泳检测
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可行性分析
导师有较为全面的相关实验经验
针对该课题我们有明确的实验测定目标而且学校可为我们提供先进的设备可以保证我们能得出精确的测定结果。
我们的导师能及时为我们解答悬疑。
4. 研究创新点
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特色创新之处
总结分析近两年中国奶牛乳房炎致病菌的分布情况
采用MLST分子分型和spa分型的方法研究临床分离的奶牛乳房炎病原中金黄色葡萄球菌的相关性
剩余内容已隐藏，您需要先支付后才能查看该篇文章全部内容！5. 研究计划与进展
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研究计划及预期进展
时间计划
计划工作及预期进展
2018年3月-7月
1、搜集相关文献资料，为实验开始。
2、认真学习好相关实验知识及技术
3、和导师交流搜集资料，制定计划书
2018年8月
1、准备好实验所需试剂，样品，工具等
2、开始试验
2018年9月-11月
1、完成对病毒的检测相关实验指标的测定
2、数据整理、统计
3、记录保存结果
2018年12月-2019年3月
1、对所得数据统计分析探讨，总结得出结论
2、尝试撰写论文
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