1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪链球菌（Streptococcus suis ,SS),是世界范围内引起猪链球菌病的最主要病原，同时也是一种重要的人畜共患病原菌。猪链球菌血清型众多，其中2 型 ( Streptococcus suis type 2 , SS2)分布最广、毒力最强、危害最严重[1]。猪链球菌引起的疾病综合征包括关节炎、脑膜炎、肺炎、败血症、心内膜炎、多糜烂、流产和脓肿等[2]。1998年和2005年在我国江苏南通地区和四川资阳地区分别暴发了由猪链球菌2型引起的猪链球菌感染疫情[3, 4]，造成了大批猪只的死亡及其相关从业人员的感染和死亡。近年来，美国、荷兰、意大利、澳大利亚和东南亚的越南、泰国等相继出现人感染猪链球菌的报道。猪链球菌病不仅给养猪业造成严重经济损失，也给公共卫生和食品安全带来威胁，受到广泛关注。猪链球菌在致病过程中能够感受环境中的各种物理和化学信号，包括糖、脂、金属元素和氨基酸等，这些物质的剥夺会促使高亲和力的营养获取系统或者合成途径的相关基因上调表达，进而协调适应性反应以促进其在宿主体内存活、扩散和致病。支链氨基酸(BCAAs[Ile、Leu和Val])是蛋白质合成的必需氨基酸，具有非常重要的生理功能。在病原菌感染过程中，BCAAs的作用非常广泛，包括蛋白质合成、脂肪酸合成、信号转导和适应氨基酸饥饿的精细调控，如诱导毒力基因的表达以适应生态位的微环境等[5]。指导教师前期研究发现，猪链球菌2型强毒株SS2-1的转录因子Rex敲除后，缺失株中支链氨基酸转氨酶（IlvE）表达水平显著降低[6]。支链氨基酸转氨酶(transaminases,TAs)是支链氨基酸合成途径上的最后一个共用酶，支链氨基酸转氨酶B是由IlvE基因编码的TAs的一种，是催化三种支链氨基酸合成最后一步反应的主要酶，它将来自脂肪族氨基酸中的a-氨基催化形成L-缬氨酸或者a-酮基谷氨酸[7]。有研究报道，变异链球菌中IlvE与细菌在酸性环境和巨噬细胞中的存活密切相关，然而该蛋白在猪链球菌中的作用尚不清楚[8]。本研究以SS2的强毒菌株SS2-1为研究对象，利用PCR扩增SS2-1的IlvE基因，将其克隆到表达质粒pET28a中，构建重组表达质粒pET28a-IlvE，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导其表达，His亲和层析柱纯化重组蛋白rIlvE；利用自杀质粒 pSET4s 构建重组缺失质粒 pSET4s::IlvE，通过同源重组技术构建缺失株SS2-1△IlvE；比较SS2-1的 IlvE 基因缺失前后，细菌的形态、生长、耐受性及毒力的变化，阐明BCCA代谢途径相关基因在猪链球菌致病过程中的作用。
参考文献：
[1] DUTKIEWICZ J, ZAJAC V, SROKA J, et al. Streptococcus suis: a re-emerging pathogen associated with occupational exposure to pigs or pork products. Part II - Pathogenesis [J]. Annals of agricultural and environmental medicine : AAEM, 2018, 25(1): 186-203.
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标：
1.获得纯化的重组蛋白rSsIlvE，并制备多克隆抗体
2.获得猪链球菌2型强毒株SS2-1的IlvE基因缺失菌株
3. 研究的方法与方案
研究方法：
一、猪链球菌支链氨基酸转氨酶的原核表达及纯化
1.PCR扩增支链氨基酸转氨酶基因IlvE的ORF基因片段
4. 研究创新点
首先在猪链球菌里面研究了支链氨基酸代谢途径的相关基因与细菌毒力的关系
5. 研究计划与进展
第1-4周（2018.9.10-2018.10.1）引物的设计及PCR的建立及条件的优化
第5-10周（2018.10.1-2018.11.5）构建重组表达质粒及IlvE基因缺失株
第10-18周（2018.11.5-2018.12.31）：对基因缺失株进行生物学特性、耐受性的研究，对BALB/c小鼠模型进行攻毒试验，进行致病力分析
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