1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪细小病毒病是由猪细小病毒（procine parvoviurs，PPV）引起，PPV为无囊膜单股线性DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称结构，直径介于18-22nm之间，病毒基因组的大小约为5kb[1]。病毒通过胎盘屏障后可以感染胚胎，是母猪障碍的主要病原之一，主要引起出产母猪的繁殖障碍和仔猪的皮肤破损等症状，临床表现为妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎、畸形胎产仔不足以及母猪不育等繁殖障碍[2]。该病与1966年首次发现与英国，1967年Cartwright等从猪流产的胎儿中分离PPV，首次证明它的致病作用。PPV与猪圆环病毒2型（Porcine circoviurs type 2，PCV2）混合感染，[3-4]可使断乳仔猪多系统衰竭综合症（Porcine postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的临床症状加剧，给养猪业带来巨大的经济损失。因此，加强猪细小病毒病诊断技术的研究对预防和控制疾病具有重要的意义[5] 。目前实验室里有几种常用检测方法，其中，血清学诊断方法是检测PPV血清抗体的重要手段之一。血清学诊断在PPV的早期诊断、流行病学调查和监测方面发挥着重要的作用；其次，血清学诊断方法也是免疫猪群抗体水平监测的主要方法。然而，常规的血凝和血凝抑制试验、补体结合试验、中和实验等存在着很多的不足之处，费时费力的同时且特异性和敏感性不高[6]。ELISA诊断方法的特异性和敏感性强、重复性好、操作方便易行、检测快速、价格低廉，是目前发展最快速应用最广泛的血清学诊断技术，有效应用于传染病的检疫、流行病学的调查以及免疫检测等方面。PPV的VP2蛋白是病毒衣壳蛋白，通过检测VP2抗体，可以了解疫苗的免疫效果。在尚未进行免疫的情况下，可以通过检测抗体筛查淘汰感染动物，从而来逐步净化群体[7]。VP2蛋白作为PPV的主要结构蛋白，包含有多个线性和构象性的抗原表位，对PPV的诊断方法研制具有重要的作用[8]。 ELISA是 20世纪 70年代初期由荷兰学者 VanWeeman与 Schurrs和瑞典学者 Engvall与 Perlman几乎同时提出的 。最初 ELISA主要用于病毒和细菌的检测 , 20世纪 70年代后期开始广泛应用于抗原 、抗体的定性 、定量测定 , 范围涉及到一些药物 、激素 、毒素等半抗原分子的定量检测 。国内外已有不少将酶免疫技术应用于检测食品中农药 、兽药残留的报道 ,使其在现代医学和食品检验学中得到广泛应用 。由于ELISA检测所需仪器化程度低 、操作简便 , 特别是对样本预处理要求简单 ,易于推广 , 具有准确 、灵敏 、快速 、特异 、经济等特点 ,国际上许多权威机构将其列为优先发展的分析技术之一[9-11] 。
[1]刘建奎,杨小燕,魏春华,戴爱玲,李晓华.猪细小病毒、猪圆环病毒2型和伪狂犬病病毒多重PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学,2010,40(11):1151-1155.
[2]Gottschalk M,Higgins R,Quessy S. Dilemma of the virulence of Strptococcus suis strains.[J]. Journal of clinical microbiology,2000,37(12).
2. 研究的基本内容和问题
研究目标： 用纯化了的PPV的VP2蛋白进行包被，优化反应条件和体系，建立针对PPV抗体的ELISA检测方法，从而达到对PPV的方便有效的监测。
研究内容： （1）引物的设计合成；（2）病毒基因组DNA的提取；（3）VP2基因的PCR扩增；（4）VP2基因表达载体的构建与鉴定；（5）重组蛋白的表达与纯化；（6）重组蛋白的western-blot活性检测；（7）间接ELISA诊断方法的建立（包括特异性、敏感性、重复性和比较性试验）；（8）试验的实际应用。
3. 研究的方法与方案
研究方法：用纯化的VP2蛋白进行包被，建立猪细小病毒抗体间接ELISA的检测方法。
可行性分析：本研究使用的间接ELISA技术优点突出，技术成熟，具有可行性。且所使用的技术及仪器在普通实验室都能进行。此技术成功建立后，能为养殖生产带来巨大的利润。
4. 研究创新点
目前，检测 PPV抗体的诊断方法主要有血凝和血凝抑制试验、中和试验等。常规检测方法费时费 力，不 易 标 准 化，而 且 特 异 性 和 敏 感 性 不 高ELISA具有特异性和敏感性强、重复性高、检测速度快、易于标准化等优点，是当前动物传染病检疫流行病学调查广泛采用的血清学检测技术。VP2 蛋白是 PPV 主要结构蛋白和免疫原性抗原，其在体外表达后，不仅具有良好的免疫原性，而且可以诱导产生强烈的免疫应答反应。本实验旨在利用VP2蛋白建立一种快速高效的检测方法，为养殖业提供便利的检测方法。
5. 研究计划与进展
2019年3月底用猪细小病毒E-LISA试剂盒检测200分血清样品，挑选出阴性和阳性样品
2019年4月（1）测定已有VP2蛋白浓度（2）确定VP2蛋白的包被浓度（3）确定一抗血清的稀释倍数 （4）确定一抗的孵育时长
2019年5月 （1）临界值确定，计算符合率（2）测定间接ELISA诊断方法的特异性、敏感性、重复性和比较性试验 （3）临床样本的检测
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