1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
意义：胸膜肺炎放线杆菌血清型多达15种，且目前还有很多不能定型的临床分离菌株，其流行率因地理区域而异，不同血清的毒力和免疫原性存在差异，APP外毒素在致病与免疫中起着重要作用，不同血清型分泌的外毒素不一样[1]。APP的分离鉴定和准确的血清分型对于疫情诊断、疫情流行病学调查和该病的防治尤为重要。胸膜肺炎放线杆菌血清型比较复杂，具有地方特异性，同时各血清型之间也很难产生较强的交叉保护作用。感染本病后往往容易出现继发感染，增加了防控的难度。另外，感染过本病且耐过的猪成为潜在的传染源[2]。因此，及时准确地分离鉴定APP，研制新型兽药制剂及新型疫苗，对防控本病具有重要的指导意义有效地预防和控制猪传染性胸膜肺炎，对保护和促进养猪业的健康发展有重要的意义。溶血活性a胸膜肺炎菌株且被认为在毒性中起重要作用[3]。然而，对这些菌株溶血素的性质还知之甚少。
国内外研究概况：APP 现共有15个血清型，分别为1型~12型、15型为生物Ⅰ型，13型和14型为生物Ⅱ型。APP对猪致病的几个毒力因子，包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶、渗透因子及溶血素等，在所有致病因子中最重要的是溶血外毒素(Actinobacillus pleuropeumoniae-RTX-toxin，Apx），它对许多细胞，包括巨嗜细胞都具有细胞毒性作用[4]。其中ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ在一定程度上能引起猪胸膜肺炎典型临床症状和肺部病变。胸膜肺炎放线杆菌血清型较多，不同国家和地区流行的血清型不同。国外针对APP的感染情况检测主要从屠宰场和猪场两个方面进行，其中屠宰场以肺脏和血清为检测对象，通过病变程度和血清阳性率来判断猪群
感染状态，采用的方法为肉眼观察法和ELISA；猪场主要以血清为检测对象，采用ELISA，也有少量报道以鼻腔拭子为检测对象，采用聚合酶链反应PCR。国内对APP感染状况的调查主要针对猪场，以IHA检测血清为主，使用ELISA和PCR的报道很少[5]。
2. 研究的基本内容和问题
目标：传染性胸膜肺炎放线杆菌分离与鉴定。
内容：首先确定是否为传染性传染性胸膜肺炎放线杆菌，确定为传染性传染性胸膜肺炎放线杆菌。再确定它的血清型，对其做生化反应实验和药敏试验，2型和5型才能同时表达出三种毒素，最后对2型和5型表达出来的毒素进行分析。
拟解决的关键问题：对表达出来的毒素蛋白进行鉴定分析。
3. 研究的方法与方案
研究方法：通过实验法研究。
技术路线：鉴定是否为传染性胸膜肺炎放线杆菌→鉴定是否传染性胸膜肺炎放线杆菌2型和5型→生化反应实验和药敏试验→鉴定毒素蛋白是否表达，表达量的高低→通过表达条件的优化，提高它的表达量。
实验方案：采用PCR程序，用通用引物跑核酸胶，确定是否为传染性胸膜肺炎放线杆菌。再采用PCR程序，使用分型引物，对传染性胸膜肺炎放线杆菌分型，确定2型和5型。用哥伦比亚肉汤培养细菌，跑SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定培养后的细菌蛋白。
4. 研究创新点
在哥伦比亚肉汤中添加1的异维他林（BBL）和10ug/ml的NAD和10mM的CaCl2 。细菌在37℃，于哥伦比亚琼脂上过夜培养，从该培养物中，接种到哥伦比亚肉汤液体培养基中，摇（130rpm）培养OD值到0.8。培养到对数期或对期中期，把菌体沉淀，取上清液，将上清液浓缩5-10倍，跑SDS-Page配制电泳，鉴定是否有蛋白表达。拿抗体做Western-Blot，看目标条带能否曝出，是否有蛋白。
5. 研究计划与进展
研究计划：将细菌在超净台里z字型划线于培养皿上，置于37℃培养箱里培养12小时，长出细菌后，在超净台里，TSB液体培养基按3ml加100ul辅酶和200ul血清，取700ul分装于EP管中，用枪在培养皿上挑单菌，吹打入EP管，37℃，200rpm摇12小时，再接种于试管中。使用通用型引物确定传染性胸膜肺炎放线杆菌，然后用分型引物确定传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型是否为2型和5型。对其做生化反应试验和药物敏感试验。将2型和5型的细菌在试管里过夜摇，第二天接种于锥形瓶中，摇至OD值0.8，培养到对数期或对期中期，把菌体沉淀，取上清液，将上清液浓缩5-10倍，跑SDS-PAGE配制电泳，鉴定是否有蛋白表达，看上清液跑电泳，看110-130KDa上是否有条带。拿抗体做Western-Blot，看目标条带能否曝出，是否有蛋白。
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