1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
微管亲和调节激酶4 (MARK4)是amp活化蛋白激酶(AMPK)相关激酶家族的成员之一，有报道称其在多种组织[1]中表达。微管亲和力监管激酶(标志)的家庭包含四个成员,MARK1 (Par-1c) MARK2 (Par-1b / EMK1), MARK3 (Par-1a / C-TAK1)和MARK4 (Par-1d / MARKL-1),他们共享一个高度保守的结构组成的三个不同的领域: 一个催化激酶域，一个泛素相关域和一个激酶相关域[2]和三个保守功能位点(赖氨酸 88ATP 结合位点、天冬氨酸 181 活性位点和苏氨酸 214 磷酸化位点。通过核心片段扩增和5'和3'比对，MARK4基因覆盖3216 bp, ORF为2259 bp，编码752个氨基酸。MARK4蛋白计算分子量(Mw)为82535.70 Da，等电点(PI)为9.70。该氨基酸(AA)序列包含多个保守的功能位点，包括一个质子受体(Asp181)、一个蛋白激酶atp结合区域特征(IIe65-Lys88)、一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点特征(IIe177-Leu189)和一个蛋白激酶结构域(Tyr59-IIe310)。根据在线SABLE程序预测的结果，MARK4蛋白的二级结构为13个a-螺旋、13个p-链和26个螺旋。
Northern印迹实验[10,12,13]和基于半定量PCR的分析[11]对不同生物（人，大鼠和小鼠组织）的研究表明，MARK4主要在脑中表达，其次是睾丸和肺[12]。一般情况下，MARK4L在睾丸、脑、肾、肝和肺中均有高表达[11,12,13]，而MARK4S在睾丸、心脏和脑中均有升高[10,11]。大鼠组织的Northern印迹分析显示，MARK4L和S在睾丸中的表达水平是相等的[11]，而半定量PCR结果显示小鼠的睾丸中的MARK4L水平升高，脑中的MARK4S水平升高[11]。大鼠大脑皮质和海马体的免疫组织化学研究显示，脑灰质神经元中有MARK4L和S的表达[11]。此外，还在神经元样突起的顶端观察到MARK4(推测为L亚型)[12]。
研究表明，Mark4参与多种生理过程，包括调节程序性细胞死亡[3]、细胞增殖[4]、葡萄糖稳态和能量代谢[5]。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
本研究旨在利用5’和3’RACE扩增技术克隆猪MARK4 基因全长cDNA，运用生物信息学技术注释猪MARK4 基因序列结构特征， 并利用q-PCR技术检测猪Mark4基因在各组织表达差异性。
2.研究内容
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
1.1 MARK4基因的全长cDNA克隆：使用RNAiso Plus (TaKaRa, 东京, 日本)从长白母猪胎盘中分离总RNA，然后使用DNase I以及重组无RNA DNase I试剂盒(TaKaRa,东京, 日本)降解基因组DNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度分析(260/280比)测定分离RNA的数量和质量。
cDNA以来自胎盘的总RNA (1 ^g)为模板，Oligo dT18为引物，使用PrimeScript 1 st strand cDNA Synthesis kit (TaKaRa, 东京, 日本)进行合成。MARK4F/MARK4R的失效引物对是根据各种脊椎动物物种的可用序列中高度保守的区域设计的。PCR扩增1 ^L逆转录(RT)反应，总容量为50 rL和1 ^L Tks Gflex DNA聚合酶(1.25 U/rL;TAKARA，东京，日本)。PCR循环条件为94°C循环1分钟, 98°C循环35个循环10秒，55°C循环15秒，68°C循环1分钟, 72°C循环5分钟。PCR产物经MiniBEST琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒Ver.4.0 (TaKaRa, 东京, 日本)纯化，并在TaKaRa生物技术大连)有限公司(中国大连)进行测序。使用ABI PRISMTM3730XL DNA测序仪(美国应用生物系统公司,沃尔瑟姆,MA)进行正向和反向测序。利用SeqMan NGen15软件在DNASTAR Lasergene 15.2 (DNASTAR, Madison, WI, USA)中进行正向序列和反向序列的组装，获得MARK4基因的核心片段。根据该片段的序列信息，设计了3'RACE和5'RACE的基因特异性引物。
4. 研究创新点
我们首次利用5 '和3 '种扩增从猪胎盘中克隆了MARK4基因的全长cDNA，并利用生物信息学分析猪MARK4基因的分子特征和结构,并利用q-PCR技术分析猪MARK4基因在不同组织器官中的差异性表达。
5. 研究计划与进展
（1）2019年3月-2019年6月，资料收集及前期准备工作
（2）2019年9月-2020年1月，相关预实验及正式实验，包括样品处理、cDNA的克隆、实时定量PCR分析等，同时数据收集、分析、讨论、总结。
（3）2020年4月，总结、整理资料；撰写学术论文
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