日粮纤维水平对二花脸猪肠道通透性和结肠细胞增殖与凋亡基因表达的影响开题报告

3.试验分组和日粮管理

每个品种猪随机分为3个处理组，每组5个重复，使用奥饲本全自动生产性能测定系统进行饲喂，每头猪都能独立获取体重、采食量等信息，因此每头猪分别被认定为1个重复，试验期间所有猪只自由采食和饮水。试验预试期10 d，所有猪饲喂基础日粮；正试期28 d，3个处理组分别饲喂不同处理日粮。中性洗涤纤维水平分别为12.84%、14.43%、15.84%。

4.试验方案

1)采样

采用奥斯本FIRE种猪生产性能测定系统收集每天每头猪的体重、采食量数据，并计算猪只平均日采食量、平均日增重、料重比。该数据已用于曹旸师姐硕士毕业论文，本文并不涉及。

在28 d正试期后，颈静脉采集血液，4℃下3000 g离心10 min，小心吸取血清至1.5 mL离心管。将血清样品储存在-80℃备用，用于分析内毒素、DAO和D-乳酸。所有试验猪只按照应激最小化原则电击致晕、放血后，流水线上打开腹腔，取出完整胃肠道，分离出大肠。在结肠中部截取约4 cm肠段，用生理盐水浸泡去除内容物，用无菌载玻片刮取肠道黏膜，装至2 mL高压灭菌过的冻存管中。将结肠黏膜样品迅速放入液氮中保存，实验室-80℃保存，用于肠道细胞增殖、凋亡基因表达的定量分析。

2)指标测定及方法

（1）肠道通透性血清学检测 使用南京建成生物工程研究所ELISA 试剂盒检测血清中内毒素、DAO和D-乳酸的含量，操作步骤参照产品说明书，使用ELISA Calc 软

件制作标准曲线，并计算样品中内毒素、DAO和D-乳酸的含量。

（2）结肠细胞增殖、凋亡基因表达量测定

①黏膜样品中RNA的提取（TRIZOL法）

a.用无菌处理过的镊子取适量肠黏膜样品至2 mL加厚高压灭菌离心管中，放入两粒处理过的瓷珠，加入1000μLTrizol，放入组织研磨仪中1800 rpm剧烈震荡2 min。

b.静置5 min后加入200 μL氯仿，离心管在漩涡振荡器上混匀20 s，静置2 min后4℃，12000 rpm离心10 min。

c.吸取500 μL上清到1.5 mL离心管中，加入500 μL -20℃预冷的异丙醇，离心管在漩涡振荡器上混匀20 s，静置10 min后 4℃，12000 rpm离心10 min。

d.取出离心管可见管底RNA白色沉淀，小心弃去上清，加入1000 μL-20℃预冷的75%乙醇（使用DEPC水配制），轻轻吹打洗涤沉淀， 4℃，10000 rpm 离心 5 min。

e.小心弃去上清，再用预冷的75%乙醇洗涤一次，4℃，10000 rpm 离心 5 min。

f.小心弃去上清，将离心管在通风橱中风干20 min，待乙醇全部挥发后加入50 μL DEPC（Rnase-free）水溶解RNA。

g.用微量分光光度计尽快测定RNA浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性，之后于 -80℃储存。

h.以上步骤全部在冰上进行。

②符合质量要求的RNA利用反转录试剂盒（Vazyme，南京）反转录为cDNA。

a. 在RNase-free离心管中配制如下混合液：

用移液器轻轻吹打混匀。42℃反应 2 min。

b.在第1步的反应管中直接加入5 × HiScript III qRT SuperMix用移液器轻轻吹打混匀。

c. PCR仪上37℃反应15 min，然后 85℃反应5 sec。

2)指标测定及方法

（1）肠道通透性血清学检测 使用南京建成生物工程研究所ELISA 试剂盒检测血清中内毒素、DAO和D-乳酸的含量，操作步骤参照产品说明书，使用ELISA Calc 软

件制作标准曲线，并计算样品中内毒素、DAO和D-乳酸的含量。

（2）结肠细胞增殖、凋亡基因表达量测定

①黏膜样品中RNA的提取（TRIZOL法）

a.用无菌处理过的镊子取适量肠黏膜样品至2 mL加厚高压灭菌离心管中，放入两粒处理过的瓷珠，加入1000μLTrizol，放入组织研磨仪中1800 rpm剧烈震荡2 min。

b.静置5 min后加入200 μL氯仿，离心管在漩涡振荡器上混匀20 s，静置2 min后4℃，12000 rpm离心10 min。

c.吸取500 μL上清到1.5 mL离心管中，加入500 μL -20℃预冷的异丙醇，离心管在漩涡振荡器上混匀20 s，静置10 min后 4℃，12000 rpm离心10 min。

d.取出离心管可见管底RNA白色沉淀，小心弃去上清，加入1000 μL-20℃预冷的75%乙醇（使用DEPC水配制），轻轻吹打洗涤沉淀， 4℃，10000 rpm 离心 5 min。

e.小心弃去上清，再用预冷的75%乙醇洗涤一次，4℃，10000 rpm 离心 5 min。

f.小心弃去上清，将离心管在通风橱中风干20 min，待乙醇全部挥发后加入50 μL DEPC（Rnase-free）水溶解RNA。

g.用微量分光光度计尽快测定RNA浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性，之后于 -80℃储存。

h.以上步骤全部在冰上进行。

②符合质量要求的RNA利用反转录试剂盒（Vazyme，南京）反转录为cDNA。

a. 在RNase-free离心管中配制如下混合液：

用移液器轻轻吹打混匀。42℃反应 2 min。

b.在第1步的反应管中直接加入5 × HiScript III qRT SuperMix用移液器轻轻吹打混匀。

c. PCR仪上37℃反应15 min，然后 85℃反应5 sec。

③利用实时荧光定量PCR仪器进行定量分析

使用20μL体系（Vazyme，南京），体系内各成分如下：EvaGreen2XqPCRMasterMix10 μL，上下引物各0.6 μL，双蒸水6.8μL，DNA模板2 μL，每个样品重复三次。其中引物序列信息见表2。

表2结肠细胞凋亡与增殖基因引物序列信息

参考文献：

[1] Xun W, Shi L, Zhou H, et al. Effects of curcumin on growth performance, jejunal mucosal membrane integrity, morphology and immune status in weaned piglets challenged with enterotoxigenic Escherichia coli [J]. Int Immunopharmacol, 2015, 27(1): 46-52.

[2] Zhou X, Zhang Y, Wu X, et al. Effects of Dietary Serine Supplementation on Intestinal Integrity, Inflammation and Oxidative Status in Early-Weaned Piglets[J]. Cell Physiol B iochem, 2018, 48(3): 993-1002.

5.试验路线