1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
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课题意义
卵母细胞来源于原始生殖细胞，胚胎发育期间，在雌性个体环境下，生殖嵴发育为卵巢，原始生殖细胞进入生殖嵴后继续进行有丝分裂，此时雌性生殖细胞称为卵原细胞，卵原细胞边增殖边向皮质迁移，大约在第二代卵原细胞时达到皮质[1]。随后，在出生前后卵原细胞完成最后一次有丝分裂，开始陆续进入减数分裂，进入减数分裂的卵原细胞称为卵母细胞，刚形成的卵母细胞称为初级卵母细胞，初级卵母细胞卵黄颗粒增多，卵母细胞体积增大，开始出现透明带。随着胚胎的生长大多数卵母细胞死亡消失，直到出生时留有少部分进入减数分裂的卵母细胞形成原始卵泡，建立原始卵泡库[2]。在初情期前，一些卵泡在有腔期早期被募集继续生长最后生长成有腔卵泡，此时的初级卵母细胞被阻滞在MI期的双线期，部分处于静息期的有腔卵泡会由于各种原因闭锁退化。初情期后卵巢内部分有腔卵泡被周期性募集而生长发育。排卵前，在黄体生成素峰的作用下初级卵母细胞完成第一次减数分裂，形成次级卵母细胞并最终停滞在MII中期，在受精的刺激下继续分裂成卵子[3][4]。
卵巢内有初级、次级、成熟（未排出）的卵子，通常对猪卵母细胞的采集和体外培养试验中采集的卵母细胞为卵丘细胞层包裹完整由致密5～2层AB级别的卵丘卵母细胞复合体[5]，在猪卵巢COCs采集时，发现大量完全裸露且没有透明带，比颗粒细胞大很多的小卵，此前未见有记载研究。王峰等[6]研究发现，卵巢保存时间不得超过6h，否则细胞发育率会显著下降。因此，如何快速、高效的采集小卵对于后续的研究非常重要。本次实习将猪卵巢中数量较多且较易获得的小卵作为研究对象，用传统抽吸法获取卵泡液，并在体视显微镜下用口吸管收集一定数量的小卵，并进一步尝试用显微操作、梯度离心法、细胞过滤筛、酶消化分离法，分别记录采集情况和存活情况，尝试验证小卵可以被以上方法分离纯化，为后续建立小卵的快速分离纯化方法提供思路和依据，从而获得纯净、有活力的小卵，为确保后续的小卵核型观察和核移植的试验提供更好的实验模型。
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1.研究目标
验证性成熟猪卵巢内未形成透明带小卵的可以被有效分离纯化，并有一定活性。
2.研究内容
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研究方法
（1）采集和初次分离小卵液：
将刚剪下的猪卵巢置于37℃的生理盐水内，并于2h内送到实验室，再用等温的生理盐水冲洗2~3次，选取直径1~5mm的卵泡，用一次性注射器刺破并吸取卵泡液(避开血管)。将所得卵泡液置于无菌的收集管内，在体视显微镜下用较细的口吸管捡小卵，进行初次的分离。用ABC三种方法分别对小卵进行进一步分离纯化。
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通常对猪卵母细胞的采集和体外培养试验中采集的卵母细胞为卵丘细胞层包裹完整由致密5～2层AB级别的卵丘卵母细胞复合体，对这种在卵内大量存在、完全裸露且没有透明带，比颗粒细胞大很多的小卵，此前未见有记载研究。本次实习将猪卵巢中数量较多且较易获得的小卵作为研究对象，尝试建立小卵快速高效的分离纯化方法，旨在获得纯净、有活力的小卵。
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本人在2019年12月进行小卵分离的预实验，熟悉相关实验操作并阅读文献和相关书籍，明确卵巢内卵子发生机制、卵泡发生机制、卵子退化机制和有关核移植的内容。2020年2月在指导教师的指导下确立了研究内容，根据本项目研究内容的需求，寒假过程中阅读了国内外的有关资料，了解了近几年有关卵子实验和细胞纯化分离的研究，并确定了研究路线。大四下学期进行正式实验。接下来导师将指导我们设计补充实验，使实验内容更完整，得出更完善的结果。实验预期进展为：
2019年12月-2020年1月，查阅文献，预实验，确定研究课题
2020年2月-2020年3月，撰写开题报告并确定试验流程及测试指标
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