1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
胆碱是反刍动物日粮中常用的一种饲料添加剂，广泛存在于生物体和饲料内，常用于缓解反刍动物夏季热应激，治疗奶牛产后瘫痪以及酮血症等代谢性疾病。另外，对于泌乳早期的奶牛而言，胆碱还能起到提高乳脂率的作用。反刍动物胆碱大部分来自饲料中植物细胞膜的磷脂酰胆碱以及部分游离态胆碱，同时机体还可利用饲料中的蛋氨酸、甜菜碱等经过甲基化等路径生成胆碱。天然饲料原料中的胆碱、磷脂(卵磷脂)以及添加剂中的胆碱被反刍动物摄入后，可被瘤胃细菌等微生物迅速降解，从而形成游离胆碱[1]。游离态的胆碱经过瘤胃微生物的作用进一步反应得到三甲胺(TMA)，部分三甲胺能在瘤胃内积聚，另一部分经过一系列生理生化过程形成甲烷，最后排出体外[2]。当瘤胃中三甲胺积聚过多时，甲烷生成路径也会达到饱和状态，致使多余的三甲胺沉积在体内。而过量的三甲胺能通过门静脉转运至肝脏后在黄素氧化酶3(FMO3)的作用下生成氧化三甲胺(TMAO)，研究表明TMAO与血管的氧化应激反应、心脑血管疾病以及消化系统恶性肿瘤都有密切的关系。随着宏基因组学、基因测序以及生物信息学等学科和技术的发展，学者们通过研究人类以及其他动物（包括昆虫，鱼类和哺乳动物）的肠道分离物发现，能够利用胆碱生成TMA的细菌均为兼性厌氧菌或专性厌氧菌，且普遍含有胆碱TMA裂解酶基因CutC[3]。尽管科学家们发现能够利用胆碱的细菌普遍含有CutC基因，但具体是哪些细菌尚不明确，并且能够影响肠道中胆碱和其他潜在三甲胺前体水平的因素，例如其他细菌的代谢活动以及其他环境因素，也尚不清楚。
作为温室气体之一的甲烷，其排放问题因局势逐渐严峻的全球温室效应而引起了人们广泛的关注。瘤胃甲烷的生成不仅是反刍动物摄入饲料能量的损失，还是重要的温室气体来源。然而,目前仍有大量甲烷菌的产甲烷机制及特性尚未被了解。因此，瘤胃甲烷减排一直是反刍动物营养研究领域的热点。研究发现，瘤胃甲烷主要是瘤胃甲烷菌通过自身与其他瘤胃微生物（例如瘤胃细菌、瘤胃原虫以及厌氧真菌等）之间的种间氢传递来利用H2、CO2、甲酸和乙酸等生成甲烷[4]。在已经发表过的文章中发现，瘤胃甲烷可通过还原CO2-H2、氧化甲酸、异化乙酸以及分化甲醇、甲胺这四种途径生成[5]。近年来，随着测序技术和体外培养技术的进步，越来越多的未知甲烷菌被发现，甲烷菌也由6个目扩展到7个目，而第七目甲烷菌“Methanomassiliicoccales"(Mmc)也已在反刍动物瘤胃[6,7]中被发现，且成为瘤胃中仅次于甲烷短杆菌目的第二大甲烷菌菌群[8,9]。体外培养、宏基因组学和基因组学研究发现Mmc甲烷菌严格厌氧，属于甲基还原营养型，具有特殊的辅酶M甲基转移酶系统(Mt)，能以氢作为电子供体，还原C1甲基化合物生成甲烷[10]。研究发现许多第七目甲烷菌能利用氢气还原三甲胺生成甲烷，如M. luminyensis[11]、Methanogenic archaeonISO4-H5[12]、Thermoplasmatales archaeon BRNA1[12]和Methanomassiliicoccus archaeon RumEn M2[13]等菌株。另有研究发现在日粮中使用富含胆碱、甜菜碱的糖蜜和小麦加工副产品等饲料原料时，或者直接添加胆碱和甜菜碱时，瘤胃中Mmc的丰度会增加[14]。但厌氧胆碱代谢与Mmc之间的关联尚不可知。
从学者们发表的论文来看，反刍动物瘤胃中存在一条将胆碱降解为三甲胺，最终生成甲烷的代谢途径。但这条代谢途径是否是含有CutC基因的微生物将胆碱降解生成TMA后，再进一步通过第七目甲烷菌Mmc利用生成甲烷还尚不明确。因此，本课题通过在瘤胃体外厌氧发酵实验中添加胆碱来探讨对甲烷生成、瘤胃中PH、挥发性脂肪酸等发酵参数以及相关微生物菌落的影响，以探究厌氧胆碱的代谢途径是否是通过含有CutC基因的微生物将胆碱降解生成TMA后，再进一步通过第七目甲烷菌Mmc利用生成甲烷的这一条代谢途径实现的，以便为瘤胃甲烷减排方面的研究提供参考。
2. 研究的基本内容和问题
（1）研究目标
利用瘤胃体外厌氧发酵法探讨添加胆碱对甲烷生成、瘤胃中pH和挥发性脂肪酸等发酵参数以及相关微生物菌落的影响，研究瘤胃胆碱厌氧代谢的代谢途径。
（2）研究内容
3. 研究的方法与方案
（1）研究方法
本课题利用瘤胃体外发酵方法，将其分为对照组和胆碱组。将新鲜瘤胃液四层纱布过滤后在厌氧条件下与缓冲液以1:9比例混合，每个发酵瓶分装60mL，发酵瓶中提前添加1%的稻秸作为底物，发酵瓶在39°C、80rpm 恒温培养箱中发酵72h。在发酵12h、24h、48h采样并用气相色谱仪测定氢气、甲烷的含量。发酵结束后立刻冰浴，测定发酵液pH，采样检测发酵液中挥发性脂肪酸、提取DNA和定量PCR。设计相关引物进行定量PCR，定量胆碱降解菌的含量、古菌以
及第七目甲烷菌的含量。
4. 研究创新点
利用瘤胃体外发酵法，研究瘤胃微生物降解胆碱的规律。
5. 研究计划与进展
（1）2019年5月 —— 2019年6月 查阅相关文献，撰写文献综述；
（2）2019年7月 —— 2019年8月 制定和完善相关实验计划；
以上是毕业论文开题报告，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
