1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）是雄性动物睾丸内具有自我更新和分化能力的生殖细胞，决定着精子发生的能力。随着科技的进步，人们对精原干细胞的认识逐渐深入，发现精原干细胞的自我更新与分化受到了细胞内部与外部的严格调控。自噬是真核生物的细胞中最普遍的生理现象，但其所发挥的作用是不可估量的的。因此，自噬也存在于精原干细胞，但是自噬的调控具有双重性。自噬在一定条件下可以清除废物为细胞提供能源，清除异常的蛋白质、受损的细胞器，维持细胞内的降解和重新利用之间的代谢平衡，抑制精原细胞等的凋亡，但同时也有可能会加快生精细胞的死亡[1]。本实验就自噬水平与精原干细胞的自我更新能力的关系进行进一步探究。
精子的发生过程一般包括精原干细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂以及精细胞变形并形成精子三个阶段。精原干细胞的自我更新是一个高度复杂而又协调一致的生理过程。要实现自我更新的稳定性就要保证细胞可以维持自身生存，进行稳定增殖，并且保持未分化的状态，以上条件缺一不可。虽然精原干细胞自我更新的调控极其复杂，但现已有大量的研究表明，许多基因及调节因子参与了该调控过程。精子的发生过程不仅受局部调节因子（如GDNF、FGF2以及PLZF等）的影响，而且与miRNAs及激素(如FSH、LH、T和E2等)等多种因素的作用[2]，而自噬在精子发生过程中发挥着重要作用。首先，细胞内的自噬信号启动，具有双层膜结构的自噬前体在细胞质中逐渐形成，盖子是前体具有特殊的杯状结构[3]。然后，在某些蛋白的刺激作用下延伸。已经完成延伸的自噬前体会包裹需要降解的底物，最终实现自噬泡的完全闭合[4]。最后，自噬泡抵达溶酶体表面并与其外膜特异性结合，在溶酶体内水解酶的作用下，自噬泡内所包裹的物质被降解作用。另外，待自噬底物完全降解后，在其溶酶体上会延伸一个可以从顶端断裂进而形成新原溶酶体的管状结构，通过溶酶体内的水解酶而形成而最终发育为成熟的溶酶体[5]。研究证实自噬型细胞死亡的发生机制主要与激素、饥饿、缺血缺氧、氧化应激、钙稳态失衡、线粒体功能障碍等有关；其信号转导通路受许多诱导因素及调控基因的影响，如mTOR、ROS、P53等。精原干细胞虽然在睾丸细胞数目中的占比很小，但是它的缺失或受损可引起不可逆性的弱精子症、少精子症甚至无法产生精子，导致不育[6]。研究发现自噬参与精子顶体的形成，自噬相关蛋白Atg-7通过调控前顶体囊泡的转运及(或)向顶体的融合而参与精子顶体的形成，抑制小鼠生精胞ATG7基因表达则导致类似圆头精子症[7]。此外，在精子细胞分化过程中，自噬可调节细胞质的重构。值得注意的是，自噬对精子发生并非有益无害，这可能与自噬发生程度有关。Liu等[8]发现，雷帕霉素通过抑制mTOR-p70S6K信号途径而提高自噬水平，抑制大鼠精原细胞增值，损坏生精小管结构，最终导致精子数量的减少。精子活力直接关系男性生育力，只有正常前向运动的精子才能抵达输卵管壶腹部，与卵子结合。精子尾部运动需要ATP提供能量，而线粒体是ATP合成场所之一。精子线粒体结构的改变可伴有能量代谢酶含量的改变，导致精子运动障碍[9]。自噬的基本功能是细胞自我修复及胞内清除，从而对细胞起到保护性作用[10]。作为细胞内物质及细胞器的重要降解途径，自噬功能异常可导致诸多疾病。在临床研究中发现，在神经细胞细胞中诱导自噬的发生与表达，可以使细胞内有害蛋白质聚合物的清除速度加快，从而减轻神经退行性疾病的发生。在肿瘤的发生与增殖过程中，其细胞内的自噬往往表现出双重作用。在肿瘤发初期，细胞的自噬表达可以有效抑制肿瘤细胞的增长 。而在后续发展过程中，往往起着抑制肿瘤细胞凋亡的作用，加快肿瘤细胞的转移[11-12]。至今为止，自噬是唯一一个被认为可以将细胞器和大分子蛋白质聚合物降解成小分子的生物过程。此外，有研究发现部分自噬蛋白甚至可以直接参与机体的免疫发生和炎症抑制[13]。目前关于自噬对精子发生及活力影响的机制尚处于基础研究阶段，主要在动物实验中开展，而基于自噬机制治疗少弱精子症的靶向药物研究报道却很少。研究发现，抗肿瘤药物环磷酰胺(cyclophosphamide，CP)可导致小鼠生精细胞数量减少，线粒体肿大且内嵴消失，伴有自噬水平上升现象(LC3和beclin-1表达上调)。而乌贼墨多糖是一种具抗氧化海洋活性物质，可通过抑制CP对小鼠睾丸生殖细胞氧化应激刺激而抑制生殖细胞自噬或凋亡[14]。此外，左卡尼汀可提高小鼠睾丸组织CP损伤细胞的自噬水平，降低生殖细胞的凋亡水平[15]。
自噬对精子的影响是双重的，自噬既可清除受损细胞器和细胞内的聚集蛋白，为细胞提供底物和能源，抑制精原细胞、精母细胞及精子的凋亡，自噬在一定条件下又可促进生精细胞死亡。这为以后男性不育的治疗提供了理论依据。然而，目前的研究大多集中于自噬现象层面，而关于自噬信号途径的研究却相对较少，而本试验将初步分析自噬在精原干细胞命运中的作用效果，并进行相关信号通路分析，以加深自噬在精原干细胞命运调控中的功能，这将对于进一步理解精原干细胞的自我更新和分化的机制以及解决男性精子发生障碍具有较为重要的意义。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标：本实验以小鼠的原代精原干细胞作为实验模型，探究自噬在白消安诱导雄性生殖干细胞损伤中的功能及机制，了解自噬在小鼠精原干细胞内的调控机制。
2.研究内容：
（1）SSCs分离与建系：通过胶原酶-胰酶消化和差异贴壁法分离纯化SSCs
3. 研究的方法与方案
本实验采用调查法和实验法：
1.SSCs的分离和培养用两步酶消化法从5-6日龄小鼠睾丸中分离出SSCs。然后将SSCs培养在有丝分裂失活的MEF细胞上。在37℃，5%的二氧化碳的培养箱中长期培养。2.RNA提取和RT-PCR睾丸组织或SSCs用TRNzol(天根，DP405)进行RNA提取，RNA逆转录使用GoScriptTM反向转录为cDNA(ProgemaA5001)。3.免疫荧光染色细胞先用卡诺在-20℃温度下固定20分钟。然后,用PBS洗涤三次，用10%的山羊血清封闭30分钟，再在4℃条件下一抗孵育过夜，PBS洗涤三次后，用二抗室温孵育1小时，细胞核用DAPI染色。最后在荧光显微镜下观察。4.蛋白质印迹法先用蛋白裂解液收集蛋白样品，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶上电泳，然后转膜，用5%脱脂牛奶封闭，在4℃条件下一抗孵育过夜，TBST洗涤三次后，用二抗室温孵育1小时，然后免疫反应条带用ECL可视化并用胶片（柯达）显现。
技术路线及方案如下所示：
4. 研究创新点
目前国内外关于自噬在生殖方面的研究较少，尤其是自噬对生殖干细胞命运的调控作用并不清楚。本实验以小鼠的原代精原干细胞作为实验模型，首次探究自噬在白消安诱导雄性生殖干细胞损伤中的功能及机制，了解自噬在小鼠精原干细胞内的调控机制，为人和动物的生殖力的保护提供参考。
5. 研究计划与进展
2019-6至2019-9文献查询与数据收集
2019-10至2020-3设计实验内容并完成实验
2020-1至2020-6完成论文撰写
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