1. 研究目的与意义
内容：本课题的内容就是利用宏基因提供的丰富物种信息，研究铁皮石斛经过采收加工流入市场后，其各种不同的加工品种中，内生真菌群落结构是否产生了变化，如果存在变化则内生真菌群落结构又是发生了怎样的变化，对铁皮石斛的产地鉴别是否会造成一定的影响，以及我们该如何应对这样的情况。
意义：铁皮石斛作为一种名贵中药材，价格昂贵并且疗效突出，深受广大消费者喜爱。
且铁皮石斛产地众多，每个产地的铁皮石斛的疗效和价格又不尽相同，因此市场上便经常出现以劣充优的现象，损害了消费者的利益，给市场监管带来不便。
2. 文献综述
内生真菌应用于铁皮石斛产地鉴别研究综述胡双（南京中医药大学 药学院 15中药2班）摘要：随着种植技术的发展，以及大市场、大流通带来的影响，部分中药材引种栽培发展迅速，导致药材地域特征弱化，产地鉴别手段不足。
内生真菌作为植物微生态的组成部分，与环境微生物紧密关联，其群落结构存在地域性差异。
因此便提出通过内生真菌群落结构地域性差异来对铁皮石斛进行产地鉴别。
3. 设计方案和技术路线
研究方案：1.确定铁皮枫斗最适宜的复苏条件选取一批有代表性的市场在售铁皮枫斗，去除其表面微生物后，分为空白对照组和处理组（包括化学试剂处理组和化学试剂与温度复合处理组）对其进行复苏处理，并采取适当方法培养，分别在培养2、3、4、5、6、7、8、9、10天后取样，最后用荧光定量PCR检测复苏情况（选择GAPDH作为内参基因，选择真菌通用引物真菌ITS1F和真菌ITS2R作为q-PCR引物），比较分析后确定最适条件。
2. 分析铁皮石斛鲜条至枫斗各种市售品的内生真菌变化过程选取一批具有代表性的市场在售铁皮石斛鲜条，再将其加工成鲜条、干条、干片和枫斗，对干品按照最适条件进行复苏，提取总基因组DNA并进行纯度鉴定，然后进行PCR扩增和观察凝胶电泳结果，最后纯化回收，分析数据和得出结论。
4. 工作计划
2月18日-3月15日学习相关实验操作并查阅整理文献，完成开题报告和综述3月16日-3月31日进行实验设计和准备相关实验仪器、材料、试剂等4月1日-5月15日 进行实验操作和处理实验数据5月15日-6月1日 撰写和修改毕业论文。
5. 难点与创新点
本项目利用环境微生物宏基因测序技术提供的丰富物种信息能更全面、准确地反映各铁皮石斛加工产品内生真菌的群落结构的变化特点，探讨铁皮石斛经过加工处理后，是否仍能利用其内生真菌群落结构来进行铁皮石斛的产地鉴别。
将其应用于内生真菌群落结构地域性差异研究中，创新性地提出了基于内生真菌群落结构地域性差异的铁皮石斛产地标签研究思路，从而有利于利用具有稳定地域特征的内生菌特异性核苷酸序列构建铁皮石斛产地标签，克服了在中药材大规模栽培背景下现有技术手段在产地鉴别中出现的区分度下降问题。
本项目的实施将为其它人工栽培药材的产地鉴别提供借鉴，为中药材原产地区分及道地性鉴别提供新的技术手段和方法。
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